總抗氧化能力 (ABTS 法)試劑盒說(shuō)明書(shū)
微量法 100T/96S
注 意:正式測定之前選擇 2-3 個(gè)預期差異大的樣本做預測定。
研究意義:
測定對象中各種抗氧化物質(zhì)和抗氧化酶等構成總抗氧化水平。在生物學(xué)、醫學(xué)和藥學(xué)研究中常常檢測血漿、血清、唾液、尿液等各種體液,細胞或組織等裂解液、植物或中草藥抽提液及各種抗氧化物(antioxidant)溶液的總抗氧化能力。
測定原理:
ABTS 法是使用Z廣泛的間接檢測方法,可用于親水性和親脂性物質(zhì)抗氧化能力測定。ABTS經(jīng)氧化后生成穩定的藍綠色陽(yáng)離子自由基 ABTS+,能溶于水相或酸性乙醇介質(zhì)中,在 734nm 處有最大吸收。被測物質(zhì)加入 ABTS+溶液后,所含抗氧化成分能與 ABTS+發(fā)生反應而使反應體系褪色。在 734nm 檢測吸光度的變化,并以 Trolox 作為對照體系量化抗氧化物質(zhì)的抗氧化能力。
自備實(shí)驗用品:
恒溫水浴鍋、低溫離心機、酶標儀、96 孔板和蒸餾水。
試劑組成和配制:
提取液:液體 120mL×1 瓶,4℃保存。
試劑一:液體 24mL×1 瓶,4℃避光保存。
試劑二:粉劑×2 瓶,4℃避光保存。
樣品的制備:
(1) 血清、血漿、唾液或尿液等液體樣品
血漿(制備時(shí)可以使用肝素或檸檬酸鈉抗凝,不宜使用 EDTA 抗凝)4℃,5000rpm 離心
10min,取上清待測。血清、唾液或尿液樣品直接用于測定,也可以-80℃凍存(不宜超過(guò)
30 d)后再測定。
(2) 組織樣品
按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為 1:5~10 的比例(建議稱(chēng)取約 0.1g 組織,加入 1mL 提取液)進(jìn)行冰浴勻漿,然后 10000g,4℃離心 10min,取上清,置冰上待測。
(3) 細胞樣品
按照細胞數量(104 個(gè)):提取液體積(mL)為 500~1000:1 的比例(建議 500 萬(wàn)細胞加入 1mL 提取液),冰浴超聲波破碎(功率 200W,超聲 3s,間隔 10s,重復 30 次);10000g,4℃離心 10min,取上清,置冰上待測。
操作步驟:
1、 酶標儀預熱 30min,調節波長(cháng)至 734nm。
2、 工作液的配置:臨用前取試劑二一瓶,加入 11mL 試劑一,震蕩混勻 20min 后,靜置,
取上清使用。(注意,現配現用)
3、操作表(在 EP 管中反應)
空白管 | 測定管 | |
提取液(μL) | 10 | |
樣品(μL) | 10 | |
工作液(μL) | 190 | 190 |
充分混勻,10min 內測定 734nm 吸光值,△A= A 空白-A 測定
注意:空白管只需測定一次,吸取工作液時(shí)不要吸到底部沉淀,若 A 測定小于 0.4,需用提取
液稀釋后檢測。
總抗氧化能力計算公式:
1、以自由基清除率表示:
ABTS 自由基清除率(%)=(A 空白-A 測定)÷A 空白×100%
2、以標準曲線(xiàn)上獲得的抗氧化劑 Trolox 的量表示:
標準曲線(xiàn):y = 0.7021x - 0.0012 R2 = 0.9985 x:Trolox 濃度(μmol/mL)
y:吸光值差值△A
單位定義:以標準曲線(xiàn)上獲得的抗氧化劑 Trolox 的量來(lái)表示樣本的 ABTS 自由基清除能力。(1)按樣本質(zhì)量計算
總抗氧化能力(μmol Trolox/g 鮮重)=(△A+0.0012)÷0.7021×V 樣÷(V 樣÷V 樣總×W) =1.424×(△A+0.0012)÷W
(2)按樣本蛋白濃度計算
總抗氧化能力(μmol Trolox/mg prot)=(△A+0.0012)÷0.7021×V 樣÷(V 樣÷V 樣總×Cpr) =1.424×(△A+0.0012)÷Cpr
(3) 按細胞計算
總抗氧化能力(μmol Trolox/104cell)=(△A+0.0012)÷0.7021×V 樣÷(V 樣÷V 樣總×細胞
數量(萬(wàn)個(gè)))
= 1.424×(△A+0.0012)÷ 細胞數量(萬(wàn)個(gè))
(3)按液體體積計算
總抗氧化能力(μmol Trolox/mL)=(△A+0.0012)÷0.7021 =1.424×(△A+0.0012)
V 樣總:加入提取液體積,1 mL;V 樣:反應中樣品體積,10μL;W:樣品質(zhì)量,g;Cpr:樣本蛋白濃度,mg/mL
注意事項:
1. 盡量避免使用在中堿性條件下呈藍色或接近藍色的試劑,否則對本試劑盒的檢測結果產(chǎn)生干擾。
2. 樣品中不宜添加 Tween、Triton 和 NP-40 等去垢劑和 DTT、巰基乙醇等影響氧化還原反應的還原劑。
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